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口腔致病菌在生物膜状态和浮游态中的特性比较

发布时间:2011/11/28 15:48:14

【摘要】在人类口腔中存在着种类繁多的天然菌群,这些细菌以牙菌斑生物膜的形式生长。菌斑生物膜作为人类龋病和牙周病的主要致病因素,有诸多代谢特点和生理现象明显不同于浮游态的细菌。下面就数种主要的口腔致病菌在生物膜状态和浮游态下的特性,如对抗菌剂的敏感性、基因表达和信号传导、耐酸性等方面的研究进展作一综述。

【关键词】口腔致病菌;生物膜;浮游状态

在自然界中,90%以上的微生物是以生物膜形式生存生长的,该结构通常为菌体在逆境条件下产生。生物膜是一种由基质包裹的相互黏附或附着于体表或界面的微生物群体,而牙菌斑作为一种典型的细菌性生物膜,是研究最多的生物被膜之一,其中大约包含500种微生物,是人类感染性疾病如龋病和牙周病的主要致病因素

在牙菌斑中,细菌从浮游的生长状态到成熟的生物膜,涉及诸多生物学特性的改变。下面以数种主要口腔致病菌为例结合生物膜的研究进展,对其在生物膜状态和浮游态下的主要特性作一综述。

1、细菌对抗菌剂的敏感性

抗菌剂的使用是控制牙菌斑的一种重要手段。有不少学者用不同的检测手段证实,生物膜中的细菌对抗菌剂的敏感性较处于浮游状态时要低很多,而口腔细菌又常以生物膜的方式致病,对多数抗菌剂具有较强的抵抗力。生物膜对抗菌剂的耐药性是一个多因素过程,主要跟生物膜结构和生理特征有关。临床上常规采用的体外药物敏感检测的最低抑菌浓度和最低杀菌浓度值,用的是浮游态细菌,而非生物膜,这就造成了实验室的药敏结果与临床疗效之间存在差异。

生物膜对抗菌剂的敏感性大大降低与生物膜中的持留细胞(persistercell)有关系。持留细胞被认为是一类数量极少并处于不生长状态的细菌细胞,既存在于浮游状态下,也存在于生物膜中,是菌群中大量正常细胞的不同表型,不同剂量的抗菌剂作用于生物膜后,总会有少量的细胞能存活下来,其表型发生转化并与亲代正常细胞具有相同的性质,即为持留细胞。正因为持留细胞对抗菌剂的高耐受性和对生物膜的专有性,生物膜中的细菌较其在浮游态下对抗菌剂的耐受性大大提高。此外,许多治疗因子在到达细菌之前与生物膜胞外多糖基质结合,其抗菌性失活。总之,上述研究强调了为什么口腔细菌的研究应该在生物膜上进行,而不应建立在浮游态细菌基础上的缘由

1.1 细菌对氯己定的敏感性

氯己定(Chlorhexidine,CHX)作为一种口腔黏膜消毒剂,具有广谱抗菌活性和强大的抑菌作用,其漱口水广泛用于口腔感染。Wilson等通过生物膜厚度发酵装置来形成血链球菌生物膜和浮游态血链球菌,分别暴露于CHX和十六烷基铵基吡啶(cetylpyridiniumchloride,CPC),结果在生物膜中的血链球菌对CHX和CPC的敏感性较浮游态下的血链球菌更低。Decker等以釉质和载玻片作为载体,在荧光显微镜下通过死菌和活菌计数计算活菌百分率来评价浮游态和生物膜血链球菌对CHX的敏感性。结果显示,经过CHX对浮游态血链球菌的预处理后,黏附后活菌百分率的平均值分别为14%~18%(釉质)和24%~25%(载玻片);相反,未经CHX预处理的生物膜血链球菌平均活菌百分率分别为70%~75%(釉质)和68%(载玻片)。

1.2 细菌对麝香草酚的敏感性

麝香草酚作为口腔科常用制剂中的成分之一,具有抗菌性和抗真菌性等药理特性。白假丝酵母菌具有潜在的毒力和致病性并能形成生物膜以抵制传统的抗真菌剂,Braga等通过白假丝酵母菌ATCC3153A和ATCCMYA2876的检测发现,麝香草酚能干预白假丝酵母菌生物膜形成的初始阶段和成熟阶段生物膜的形成,在浮游态细胞最低抑菌浓度2倍的情况下,生物膜细菌的代谢活性仅仅降低了90%左右。可见生物膜作为一种多因素现象,麝香草酚的多种机制能影响其形成的不同阶段。

1.3 细菌对地莫匹醇的敏感性

地莫匹醇可通过抑制口腔微生物黏附至牙面而影响牙菌斑生物膜的发展和成熟,在一定程度上还影响细菌的代谢从而预防和治疗牙龈炎。Burgemeister等⑾⑿通过荧光染色计算活菌数发现,在质量分数0.2%的地莫匹醇-氯化氢溶液中,血链球菌生物膜和浮游血链球菌的活菌数均显著下降;而暴露于质量分数0.05%的地莫匹醇-氯化氢溶液中时,血链球菌生物膜细菌总数并未下降,浮游态血链球菌的活菌数则下降。即在生物膜形成的初始阶段,地莫匹醇-氯化氢溶液在0.05%或是更高的质量分数下有杀菌作用,因而有较大的临床应用前景。

1.4 可见光和过氧化氢的抗菌协作效应

Steinberg等利用可见光和过氧化氢对浮游态变异链球菌的抗菌协作效应进行了证实性研究,在其研究中检测到一种可见光和过氧化氢结合体对生物膜中变异链球菌的活力和基因表达的影响力。结果显示,生物膜中的变异链球菌在浓度为3~300mol/L过氧化氢中暴露于波长400~500nm可见光下0.5或1min,抗菌效果通过对死菌或活菌计数,可见光和过氧化氢结合体在激光共聚焦扫描显微镜下对于生物膜每一层都有一种协同性的抗菌效果。此外,生物膜细菌在此种方法下较浮游态细菌更有效。综上可见,可见光和过氧化氢结合体可作为最低限度的抗菌过程应用到生物膜相关疾病的防治中。

2、细菌的基因表达和信号传导

在牙菌斑生物膜中,细菌在应对生物膜所处的复杂环境时将启动一套完全不同的基因系统,有不同的基因表达形式。Maira-Litr?觃n等发现,生物膜中的菌细胞会表达一些跟浮游细胞不同的表型。细菌在生物膜中并非以游离状态存在,而为了适应周边环境,可通过种间或种内的信号传导通路来协调群体的行为,使群体细菌表现出共同的生物学行为。

2.1 基因的转录分析

变异链球菌作为一种主要的口腔致病菌,常以生物膜的形式生活。Shemesh等采用体外比较转录分析的方法来鉴定变异链球菌在生物膜状态下和浮游状态时的基因表达,其DNA序列分析显示,大约12%的基因有显著性差异表达;在相对于浮游状态而言的生物膜状态下,有139种基因被激活,104种基因被抑制,有20种被选择基因的差异表达通过实时定量聚合酶链反应得以鉴定。该研究对变异链球菌生物膜生长过程中的基因表达提供了新的见解。

2.2 不同糖源下的转移酶应答

菌斑生物膜所处的环境反过来会对细菌的基因表达产生影响。Shemesh等采用实时定量聚合酶链反应,体外对比变异链球菌在生物膜状态和浮游状态下的相关基因对葡萄糖和蔗糖的应答。结果显示,在相对于浮游状态而言的生物膜状态下,所有变异链球菌被检基因在生物膜中起正调节作用。在他们所检测基因中,做得最多的是对编码葡糖基转移酶(glucosyltransferase,gtf)和果糖基转移酶(frucosyltransferase,ftf)基因的观察。结果显示,gtfBmRNA的诱导作用在生物膜形成中相对于浮游态是22倍,gtfCmRNA的增长作用在生物膜形成中相对于浮游态是14.8倍,ftfmRNA的诱导作用在生物膜中相对于浮游态是11.8倍。尽管在有蔗糖存在时生物膜相关基因表达中的正性调节有显著意义,但是葡萄糖的加入会降低大部分基因的表达。由此可见,糖源的种类对生物膜状态和浮游态下细菌gtf和ftf基因的表达起着重要的影响。

2.3 生物膜的抗血清反应

口腔血链球菌是牙菌斑生物膜中的先锋菌,也是口腔正常菌群的优势菌之一,与其相对的浮游生物细胞在表型上完全不同。Black等通过对血链球菌生物膜和浮游生物细胞的表型分析证实,生长方式影响血链球菌的表面性质。血链球菌生物膜经过抗血清反应后,其生物膜细菌基因库中显示产生了32种基因重组克隆,表达了21种不同的血链球菌蛋白;另外,纤维黏附素CshA及其疏水性表达在血链球菌生物膜中明显提高。在对所选用的大肠杆菌的不同分析中,其生物膜的抗血清反应有5次较浮游态细菌抗血清反应要强,即在生物膜细胞中,由cshA基因和cna基因编码的表面胶原蛋白呈正性调节,然而在浮游态中则不然。

2.4 密度感应信号系统

密度感应信号(quorumsensingsignal,QS)系统对牙菌斑生物膜的形成具有重要作用,可改变菌体生理特性并影响生物膜的结构稳定性。对链球菌QS系统的研究发现,QS系统可诱导细菌接受外源性DNA,如生活在生物膜中的变异链球菌较浮游态下的变异链球菌更容易接受外源DNA,而且变异链球菌的转化频率是其浮游态的10~600倍。大多数细菌利用QS系统调控其特定的生理功能,而且不同于浮游态下的细菌生长特点。生物膜内细菌的生理特性由密度感应信号系统调控,进而影响生物膜的发展成熟

3、细菌的代谢特点

3.1 细菌的耐酸性

成熟的生物膜细胞较在浮游状态下对于酸有更强的抵抗力。变异链球菌可在较低pH值环境下诱导出酸耐受反应以增强其生存力。Welin-Neilands等在通过死菌和活菌荧光染色研究变异链球菌生物膜的酸耐受反应能力及其耐酸性过程中发现,不同的变异链球菌菌株生物膜细胞的酸耐受反应能力是其相应浮游态下的820~7.0×104倍,较浮游细胞有更强的耐酸性。同时他们还发现,氟化物有抑制酸耐受反应的诱导作用,在pH3.5环境下仅有77%的细胞生存率。可见,变异链球菌的不同菌株具有不同的酸耐受度和不同的诱导酸耐受反应的能力。

3.2 细菌的抗饥饿性

与浮游态下的细菌相比较,生物膜中的细菌代谢特点具有多样性和复杂性。Zhu等通过激光共聚焦扫描显微镜和免疫荧光技术测定发现,生物膜状态和浮游态中的变异链球菌同时接受24h无底物的饥饿处理后,变异链球菌在生物膜状态下较浮游态具有更强的耐饥饿能力。

4、结束语

由于生物膜中的细菌无论是基因表达、代谢作用,还是其他的生理现象都与浮游态下的细菌有较大的差异;因此,研究生物膜中细菌的生理代谢特点,对于进一步明确龋病和牙周病的发病机制、防治措施以及指导临床用药均具有重要的临床意义。

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