中药单体榄香烯体外对人晶状体上皮细胞内胶原蛋白合成的影响

【摘要】目的：探讨中药单体榄香烯(effectsofe lemene,Ele)对人晶状体上皮细胞系(humanlen sepithelialcellsB3,HLE B3)内Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白合成的影响。方法：利用10μg/L碱性成纤维细胞生长因子(recombinanthuman basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)诱导HLE B3增殖，将80mg/L的Ele作用在处于增殖状态下的HLE B3，24h后采用双抗体夹心ABC 酶联免疫吸附测定法(enzyme linkedimmuno sorbentassay,ELISA)检测Ele作用后HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达。结果：rhbFGF作用后HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白浓度为53.5±5.4μg/L，较正常组(38.5±2.3μg/L)明显升高，Ele作用后HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白的浓度为29.5±2.9μg/L，较rhbFGF组明显下降(P<0.01)。rhbFGF作用后HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白浓度为1.27±0.29μg/L，较正常组(0.83±0.12μg/L)明显升高，Ele作用后HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白的浓度为0.69±0.11μg/L，较rhbFGF组明显下降(P<0.01)。结论：Ele抑制rhbFGF诱导的HLE B3增殖的同时也能抑制HLE B3内Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白合成，干扰HLE B3纤维化，可望成为防治后囊膜混浊的理想药物。

【关键词】榄香烯晶状体;上皮细胞后囊膜混浊;Ⅰ型胶原蛋白;Ⅲ型胶原蛋白

引言

胶原蛋白(collagen)或称胶原，是动物细胞合成的一种生物性高分子，是一类最主要的细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)。目前的研究表明，ECM与后囊膜混浊的关系密切：ECM是构成纤维化性混浊的重要成分。免疫电镜检查显示混浊的晶状体后囊膜的纤维有Ⅰ，Ⅲ和IV型胶原;此外ECM还可调节细胞生长分化及细胞运动。榄香烯(elemene，Ele)是天然药物莪术的主要成分，具有抗血栓形成、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡^①②，我们的研究发现Ele能抑制由重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basicfibro blastgrowth factor,rhbFGF)诱导的人晶状体上皮细胞系(humanlensepithelialcellsB3,HLE B3)增殖(另文报道)，我们进一步采用双抗体夹心ABC酶联免疫吸附测定法(enzyme linke dimmunosorbentassay，ELISA)检测Ele作用后HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白(collagenI)和Ⅲ型胶原蛋白(collagenIII)表达，探讨Ele是否在抑制HLE B3增殖的同时还能抑制HLE B3内Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白的合成，从而对阻止晶状体上皮细胞纤维化起重要的作用。

1、材料和方法

1.1 材料

人晶状体上皮细胞系HLE B3由广州中山大学眼科研究中心提供;Ele乳液，纯度99.0%，大连金港制药有限公司;rhbFGF为英国PeproTech公司;DMEM培养基、胰蛋白酶和EDTA分别是美国Gibco公司、美国Amresco公司和美国Augus公司;Ⅰ型胶原蛋白(collagenI)和Ⅲ型胶原蛋白(collagenIII)的ELISA试剂盒由上海西唐生物科技有限公司提供。自动酶标读数仪：美国BioTekELX808;倒置研究显微镜：日本IMT 413;二氧化碳培养箱：美国FORMA2111。取出保存冻存细胞的冻存管立即放入37℃水中，将溶解的细胞悬液用10倍体积以上的培养液进行稀释，离心，除上清，反复洗涤3次。以5×108个/L接种于培养瓶中，37℃，50mL/LCO2培养箱培养。待细胞生长融合后进行传代培养。

1.2 方法

80mg/LEle作用24h后收集细胞上清液;取出已经包被了抗人Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白单克隆抗体的96微孔板。设标准孔8孔，每孔各加入标准稀释液100mL，第1孔加标准品100μL，均匀后用加样器吸出100μL，移至第2孔。如此反复作对倍稀释至第7孔，最后从第7孔中吸出100μL弃去，使之体积均为100μL，第8孔为空白组。待测品孔每孔各加入细胞上清液100μL，每组6个孔;将反应板充分混匀后置37℃，120min;用洗涤液将反应板充分洗涤5次，在滤纸上印干;每孔加第一抗体工作液50μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加酶标抗体工作液100μL，置37℃，60min;同前洗板后每孔加底物工作液100μL，置37℃暗处反应10min;每孔加50μL终止液混匀。在492nm处测吸光度值;根据标准品A值画出标准曲线，根据样品A值在该曲线图上查出相应的Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白含量。

统计学分析：数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS12.0统计软件进行数据处理。

2、结果

rhbFGF组HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白含量较空白组明显增加，与空白组之间差异具有统计学意义(P<0.01;Ele组HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白含量较rhbFGF组明显下降，与rhbFGF组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。说明Ele能降低HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白含量。rhbFGF组HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白含量较空白组明显增加，与空白组之间差异具有统计学意义(P<0.01);Ele组HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白含量分别较rhbFGF组明显下降，与rhbFGF组之间差异具有统计学意义(P<0.01)。说明Ele能降低HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白含量。Ele对HLE B3内Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白含量的影响

3、讨论

胶原蛋白或称胶原，是动物细胞合成的一种生物性高分子，是ECM中最主要的一类物质。经过数十年来的研究和发展,业已发现并确认了胶原蛋白有25种类型，其中Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白约占胶原蛋白总量的80%～90%。胶原蛋白纤维化是许多疾病的病理表现之一，胶原蛋白分子的异常合成和沉积是纤维化反应的基础。如弥漫性肺纤维化早期表现为肺泡炎，后期为弥漫性肺间质纤维化,主要是肺间质中成纤维细胞数及其产生的胶原蛋白和其他结缔组织成分增多，肺泡壁遭破坏，特发性肺间质纤维化时，肺组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原增高，肺脏变硬，顺应性减退^③。有研究表明，高血压左心室肥厚时不仅存在心肌肥大的变化，心肌间质纤维化亦是重要的病理改变，Ⅰ,Ⅲ型胶原蛋白的表达增强,促进了间质的纤维化^④。ECM是构成纤维化性混浊的重要成分。免疫电镜检查显示混浊的晶状体后囊膜的纤维有Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原，ECM可调节细胞生长分化及细胞运动。纤维粘连蛋白等ECM可促进某些黏附分子磷酸化，从而促进细胞移行。白内障摘除术后，残留的晶状体上皮细胞通过细胞膜上的黏附分子与细胞外基质及细胞内骨架蛋白相连，促使细胞移行并发生晶状体后囊膜皱缩。Ishida等^⑤研究发现：米诺地尔能抑制体外培养的晶状体上皮细胞的增殖、移行及胶原分泌。张凤妍等^⑥探讨表皮生长因子、白细胞介素1、干扰素和生长抑素8肽在晶状体后囊膜混浊形成中的作用及影响胶原合成的机制，发现表皮生长因子、白细胞介素1参与晶状体后囊膜混浊形成时的胶原合成，干扰素和生长抑素8肽的作用提示其可用于防治晶状体后囊膜混浊。在本研究中，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白浓度为53.5±5.4μg/L，较正常组(38.5±2.3μg/L)明显升高，说明rhbFGF能促进HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白的合成。经Ele作用后，HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白的浓度为29.5±2.9μg/L，较rhbFGF组明显下降。结果提示，Ele能抑制HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白的合成。我们还发现，10μg/LrhbFGF作用后，HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白浓度为1.27±0.29μg/L，较正常组(0.83±0.12μg/L)明显升高，说明rhbFGF能促进HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白的合成。经Ele作用后，HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白的浓度为0.69±0.11μg/L，较rhbFGF组明显下降。本结果提示，Ele能抑制HLE B3内Ⅲ型胶原蛋白的合成。本结果提示，rhbFGF在促进HLE B3增殖的同时，也能促进HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的合成;Ele能有效抑制HLE B3内Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白的合成。进一步说明作为ECM重要成分的Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白，是构成纤维化性混浊的重要原因，也是导致晶状体后囊膜纤维化并发生混浊的重要机制。Ele有望成为防治后发性白内障的有效药物。

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