人源饲养层对人胚胎干细胞生长的影响

【摘要】目的:选择最佳人源饲养层，并检测不同组织来源的人源饲养层细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的分泌情况，探讨其水平与人胚胎干细胞(hESCs)生长是否相关。方法：原代培养包皮真皮、子宫内膜基质、绒毛、输卵管、胎儿真皮、胎儿肌肉及胎鼠成纤维细胞(MEFs);按组织来源分为7组(MEFs为对照)，同期接种同一株hESCs，从饲养层细胞密度、丝裂霉素作用时间等，寻找不同饲养层适合hESCs生长的最佳条件;按人体组织分6组，ELISA方法检测各种人源饲养层细胞分泌的bFGF。结果：根据饲养层细胞生长特性，饲养层从优到劣依次为：包皮、子宫内膜、绒毛、输卵管、胎皮、胎肌;根据hESCs生长状况，饲养层排序为：包皮、输卵管、子宫内膜、绒毛、胎肌、胎皮。输卵管、包皮、绒毛、胎肌、子宫内膜、胎皮分泌的bFGF(pg•10-5•mL-1)分别为13.23;3.39，1.99;0.17，1.40;0.17，2.02;1.59，0.38;0.28，0.29;0.29。输卵管与其它组织细胞分泌的bFGF差异均有统计学意义(P<0.01);包皮、绒毛、胎肌之间差异无统计学意义(P>0.05)，与子宫内膜、胎皮差异有统计学意义(P<0.05);子宫内膜与胎皮之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论：包皮来源的饲养层最佳，输卵管细胞分泌的bFGF量最高，饲养层细胞自身分泌的bFGF和hESCs生长无必然相关性。

【关键词】人源饲养层;人胚胎干细胞;碱性成纤维细胞生长因子

基础与临床研究表明，胚胎干细胞(humanembryonicstemcells，hESCs)及其衍生细胞移植后可以有效修复受损组织①⑤。而hESCs增殖需要营养物质及生长因子，鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblasts，MEFs)制作饲养层是最早和最常用的方法⑥⑦。然而，MEFs可能将鼠类病毒传染给患者，干细胞治疗人类疾病时，必须要求无动物源性培养。近几年，人胚胎成纤维、包皮、输卵管上皮、子宫内膜等组织来源的细胞⑧⑩，均有报道可以支持hESCs的生长，但对于各种人源饲养层的评价尚存在争议，各实验室结论不同。为选择最佳人源饲养层，引导人源组织的取舍和应用，本研究选用包皮、子宫内膜、绒毛、输卵管、胎儿皮肤、肌肉，6种不同的胎儿、小儿及成人组织作饲养层，以MEFs为对照，比较了它们对人胚胎干细胞的支持情况。MEFs促进增殖作用主要是由于能分泌成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)等促有丝分裂因子，但人源饲养层中生长因子含量复杂，哪些因子可促进hESCs增殖和抑制分化目前尚未明了。一般认为添加外源性合成的(basicfibroblastgrowthfactor，bFGF)有利于hESCs的生长，但饲养层细胞自身分泌的bFGF和hESCs生长是否存在相关性呢?我们测定了不同人源饲养层细胞分泌的bFGF，首次尝试从饲养层细胞自身分泌的bFGF角度探讨其与支持hESCs的生长是否存在相关性。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1hESCs本课题组 从人囊胚中分离培养并经过鉴定的第30代细胞。

1.1.2 组织来源取自中山大学附属一院。包皮：小儿外科的包皮环切术;子宫内膜：生殖中心子宫内膜诊刮术;胎儿皮肤、肌肉：胎儿中心胎儿引产术;输卵管、绒毛：妇产科输卵管切除术和胎儿流产术;胎鼠购自中山大学动物中心。

1.1.3 试剂及培养液 HumanFGFBasicImmunoassayKit(DFB50RD，USA);成纤维细胞培养液：90%高糖DulbeccoModifiedEagleMedium(DMEM;invitrogen，USA)，10%fetalbovineserum(FBS;Hyclone，USA)，100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素(Sigma，USA);hESCs培养液：80%Knockout-DMEM，20%Knockout-SR，L-谷氨酰胺100×β-巯基乙醇1.8μl/mL(Invitrogen，USA)，100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、非必需氨基酸100×(Sigma，USA)。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞 培养包皮、胎儿皮肤，胰酶过夜冷消化，取真皮胶原酶Ⅳ消化;胎儿肌肉、绒毛、胎鼠，0.25%胰酶消化;子宫内膜，0.1%胶原酶I消化后，将腺体沉淀取基质细胞;输卵管，0.25%胰酶消化后，将基质和上皮层分离，取基质层用0.1%胶原酶Ⅳ消化。

1.2.2 最佳饲养层条件 选择用10mg/L的丝裂霉素C分别作用各种细胞1h、1.5h、2h、2.5h、3h，用同一规格的培养皿，制作不同密度的饲养层，机械法将hESCs克隆切成3～16块，转移到铺有饲养层的培养皿中，选择最佳作用时间和密度。冻存大量同批次细胞备用，复苏后计数铺皿细胞数和未贴壁细胞数，按丝裂霉素处理和未处理分2组，比较丝裂霉C对不同细胞复苏率的影响。复苏率=(铺皿细胞数-未贴壁细胞数)/铺皿细胞数

1.2.3 饲养层 比较用同一规格的培养皿，接种相同的hESCs克隆数，计算在各种饲养层最佳条件下hESCs的贴壁率、生长率、分化率，比较饲养层优劣。贴壁率=贴壁克隆/传代克隆;生长率=生长克隆/贴壁克隆;分化率=(部分分化克隆+已分化克隆)/克隆总数。

1.2.4 bFGF检测 10mg/L的丝裂霉素C作用各种细胞2h，计数后放入培养皿，3d后吸取培养液，离心取上清;利用酶联免疫吸附实验的双抗体夹心法，按照DFB50RD试剂盒说明操作。

1.2.5 统计学处理 实验数据以xs表示，应用SPSS12.0软件进行统计处理，采用单因素方差分析比较各实验组之间的差异性。

2、结果

2.1 不同饲养层细胞试用情况

hESCs的生长形态及分化情况和饲养层细胞密度有关，饲养层密度小，克隆薄、圆;饲养层密度大，克隆厚、沿纤维方向生长。各种人源饲养层在一定程度上均可支持hESCs生长，以包皮较稳定。

2.2 丝裂霉素C对不同细胞复苏率的影响

对包皮、子宫内膜、绒毛、MEFs等细胞复苏率无明显影响;胎儿肌肉、胎儿皮肤、输卵管细胞处理后较未处理复苏率变差(表2)。

2.3 hESCs的生长状态

未分化hESCs：细胞小圆形，排列紧密，核仁清楚;已分化细胞：细胞大，梭形或多角形，细胞排列疏松。未分化克隆：克隆中未分化细胞>80%，可继续传代;部分分化克隆：克隆中未分化细胞50%～80%，可通过机械法将未分化部分继续传代;已分化克隆：克隆中未分化细胞<50%，不能继续传代。

hESCs在包皮上贴壁率，生长率和分化率和MEFs类似;在输卵管上贴壁率波动大，但分化率较低，形态较好;在胎皮、胎肌上贴壁率和生长率较MEFs差。

贴壁率：包皮、MEFs之间差异无统计学意义(P>0.05)，与其它组差异有统计学意义(P<0.01);子宫内膜、绒毛之间差异无统计学意义(P>0.05)，和胎皮、胎肌、输卵管差异有统计学意义(P<0.01);胎皮、胎肌差异无统计学意义(P>0.05)和输卵管差异有统计学意义(P<0.01)。

生长率：包皮、MEFs之间差异无统计学意义(P>0.05)，与其它组差异有统计学意义(P<0.01);子宫内膜、绒毛、输卵管之间差异无统计学意义(P>0.05)，与胎皮、胎肌差异有统计学意义(P<0.01);胎皮、胎肌差异无统计学意义(P>0.05)。

分化率：输卵管和所有组之间差异均有统计学意义(P<0.01);其它组间差异无统计学意义(P>0.05)(表3，图2)。

2.4 不同组织的饲养层细胞分泌bFGF结果

输卵管与其它组间差异均有统计学意义(P<0.01)，包皮、绒毛、胎肌之间差异无统计学意义(P>0.05);包皮、绒毛、胎肌与子宫内膜、胎皮之间差异有统计学意义(P<0.05);内膜与胎皮之间差异无统计学意义(P>0.05)。标准曲线r=0.99868说明本次实验技术性误差很小。

3、讨论

1998年Thomson⑥首次报道从囊胚中获得了hESCs，其发育全能性为细胞治疗和组织替代等医学领域带来广阔的研究前景，现在已成为生物医学领域的热点。传统上，培养hESCs用MEFs、无限生长系STO细胞做饲养层。由于混杂了小鼠细胞，且hESCs暴露于小鼠的逆转录病毒中，这必将给临床应用带来麻烦。目前，无饲养层、无血清、无动物源成分的培养体系尚不完善，饲养层仍是hESCs建系时不可缺少的因素。为了减少动物源成分，人源饲养层研究是一个必要的过渡阶段。本研究从人成纤维细胞的生长状态、传代情况与MEFs作比较，探讨了人成纤维细胞用于培养hESCs的可行性。

所用不同组织来源的细胞，在传代2、3次后形态均呈纤维状，但生长特性、老化进程不同。包皮增殖力最旺盛，其中一株3岁男孩的包皮细胞传55代，在40代时核型仍正常，与文献报道至少可以传42代才出现老化吻合。另外一株17岁男孩的包皮细胞，培养到32代时增殖力依然旺盛。子宫内膜基质和绒毛细胞传15代，增殖能力无明显减弱。输卵管基质细胞第四代增殖能力开始下降，细胞出现老化，胞体增大、胞浆内颗粒增多。胎儿皮肤和肌肉细胞增殖力居中，三代之后接触抑制明显，出现局部大片脱落，但细胞长满80%前仍可以继续传代，而其它细胞无抑制脱落现象。胎鼠成纤维细胞早代增殖力旺盛，可复层生长而无接触抑制，第四代之后，几乎不再增殖，5代后细胞明显老化。细胞形态与传代密度有关，密度适宜，形态较好;传代过稀，增殖减慢，则胞体变大，胞浆内颗粒增多，传代周期变长。人成纤维细胞和MEFs在体外均为贴壁生长型细胞，与MEFs相比，人成纤细胞寿命更长，在生长状况上与MEFs类似，在使用期限上优于后者。

本结论与大多数文献报道包皮可以支持hESCs生长、建系相符⑿⒁。但与2003年MarkRichards⒂认为胎儿肌肉可作为最佳饲养层有异议，可能与细胞培养条件不同有关。本实验中，胎儿肌肉细胞接触抑制明显，易脱落，饲养层细胞本身状态不佳。Richards描述胎儿肌肉较其它饲养层上的上hESCs克隆厚，本实验中观察到hESCs的生长形态及分化情况和饲养层细胞密度有关，而与组织来源无明显关系。无论哪种饲养层，饲养层细胞密度大，则hESCs克隆厚，形态除与切割形状有关外，多沿纤维方向生长，反之则薄，呈圆形、椭圆形。

丝裂霉素处理后的各种饲养层，输卵管细胞分泌的bFGF量最高，SPSS统计分析与其它组间差异均有统计学意义(P<0.01)。但hESCs在包皮和输卵管上生长形态均好，说明饲养层细胞自身分泌的bFGF和hESCs的生长虽然可能有一定关系，但无必然相关性。表现为输卵管细胞支持hESCs生长时密度低，其它组织来源的细胞密度高。但也可能与输卵管细胞体积较大有一定关系。当然，细胞培养液中各种生长因子含量甚微，各种因子协同作用复杂，需要联合其它因素才能进一步探讨它们的作用。

虽然输卵管分泌的bFGF较高，密度要求比MEFs低，传代的hESCs分化少形态好，胶原酶消化效果与MEFs类似。但是输卵管上生长的hESCs贴壁率波动很大，实验中曾有另一株hESCs超过50%以上的克隆不贴壁现象。这可能与hESCs系不同有关，也可能与培养液的批次有关。另外，输卵管需要筛选(比如排除恶性肿瘤患者)，来源相对困难，且在第四代后增殖力明显下降，老化较早，这些都限制了它的应用。子宫内膜增殖力相对旺盛，来源也很充足，所以也是一种值得推荐的饲养层;胎儿肌肉和皮肤，细胞本身传代需要严格控制时间，否则会“集体自杀”——大片脱落，给实验带来一定的不便。这种现象其它细胞尚未见发生。另外，在如今可以控制受孕的医疗条件下，引产的正常胎儿来源非常困难且涉及到伦理问题。

尽管我们实验表明流产胎儿的绒毛也可以支持hESCs生长，国内外尚未见报道，但绒毛取材相对困难，也牵涉到伦理问题。所以，应该倡议饲养层的选择不在于标新立异，而在于方便、适用。虽然似乎多种人源成纤维细胞在一定程度上均可支持hESCs生长，本研究显示包皮可作为人源饲养层的首选，并且，我们在包皮上成功地建立了一株新的hESCs系。包皮的优势体现在来源充足、属医疗废物，一般不需要病理检查，无伦理学问题;本身传代久，增殖力强，旺盛时可1：7传代;不同包皮系、冷冻复苏后及高代次细胞支持hESCs生长的能力均无差异，实验中最高用到31代。而MEFs在第5代时增殖力即明显下降呈老化状态，实验多用3～4代。与MEFs相比，包皮的储备量是很惊人的，这就减轻了反复培养原代饲养层细胞的工作负荷。

现阶段的培养方法尚不能在短期内大量扩增hESCs，减少动物源性物质只是基本前提，最终目标是找到类似鼠胚胎干细胞培养中的骨形态发生蛋白拮抗剂Noggin和白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)作用的细胞因子⒃⒄，使hESCs的自我更新具有可控性，建立起无饲养层、无血清和无动物来源成分的稳定的、标准的培养体系。

【参考文献】

[1]Cho MS，Hwang DY，Kim DW.Efficient derivation of functional dopaminergic neurons from human embryonic stem cells on a large scale [J].Nat Protoc，2008，3(12)：1888-1894.

[2]Lu SJ，Ivanova Y，Feng Q，et al.Hemangioblasts from human embryonic stem cells generate multilayered blood vessels with functional smooth muscle cells [J].Regen Med，2009，4(1)：37-47.

[3]Karner E，Backesjo CM，Cedervall J，et al.Dynamics of gene expression during bone matrix formation in osteogenic cultures derived from human embryonic stem cells in vitro [J].Biochim Biophys Acta，2009，1790(2)：110-118.

[4]Mao GH，Chen GA，Bai HY，et al.The reversal of hyperglycaemia in diabetic mice using PLGA scaffolds seeded with islet-like cells derived from human embryonic stem cells [J].Biomaterials，2009，30(9)：1706-1714.

[5]Li Z，Han Z，Wu JC.Transplantation of human embryonic stem cell-derived endothelial cells for vascular diseases [J].Cell Biochem，2009，106(2)：194-199.

[6]Thomson JA，Itskovitz EJ，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell line derived from human blastocysts [J].Science，1998，282(5391)：1145-1147.

[7]Inamdar MS，Venu P，Srinivas MS，et al.Derivation and characterization of two sibling human embryonic stem cell lines from discarded Grade III embryos[J]. Stem Cells Dev，2009，18(3)：423-433.

[8]Kumar N，Hinduja I，Nagvenkar P，et al.Derivation and characterization of two genetically unique human embryonic stem cell lines on in-house derived human feeders [J].Stem Cells Dev，2009，18(3)：435-445.

[9]Sidhu KS，Ryan JP，Tuch BE.Derivation of a new human embryonic stem cell line，endeavour-1，and its clonal propagation [J].Stem Cells Dev，2008，17(1)： 41-51.

[10]Meng G，Liu S，Krawetz R，et al.A novel method for generating xeno-free human feeder cells for human embryonic stem cell culture [J].Stem Cells Dev， 2008，17(3)：413-422.

[11]Lee JB，Lee JE，Park JH，et al.Establishment and maintenance of human embryonic stem cell lines on human feeder cells derived from uterine endometrium under serum-free condition [J].Biol Reprod，2005，72(1)：42-49.

[12]Ellerstrom C，Strehl R，Moya K，et al.Derivation of a xeno-free human embryonic stem cell line [J].Stem Cells，2006，24(10)：2170-2176.

[13]Stram S，Inzunza J，Grinnemo KH,et al.Mechanical isolation of the inner cell mass is effective in derivation of new human embryonic stem cell lines [J]. Hum Reprod，2007，22(12)：3051-3058.

[14]Feki A，Bosman A，Dubuisson JB，et al.Derivation of the first Swiss human embryonic stem cell line from a single blastomere of an arrested four-cell stage embryo [J].Swiss Med Wkly，2008，138(37-38)：540-550.

[15]Mark Richards.Comparative evaluation of various human feeders or prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells [J].Stem Cells， 2003，21(7)：546-556.

[16]Trouillas M，Saucourt C，Guillotin B，et al.Three LIF-dependent signatures and gene clusters with atypical expression profiles，identified by transcriptome studies in mouse ES cells and early derivatives [J].BMC Genomics，2009，10：73.

[17]Chiba S，Lee YM，Zhou W，et al.Noggin enhances dopamine neuron production from human embryonic stem cells and improves behavioral outcome after transplantation into Parkinsonian rats [J].Stem Cells，2008，26(11)：2810-2820.